柯萨奇病毒A16(CVA16)是小核糖核酸病毒科肠道病毒属的成员，是婴幼儿中流行的手足口病 (HFMD)的主要病原体之一。CVA16感染可能导致自限性疾病以及严重的临床结果，例如脑炎、心肌炎、肺炎，甚至死亡。此外，CVA16经常与其他引起手足口病的病原体共同传播，例如人类肠道病毒A71(EV71)、柯萨奇病毒A6(CVA6)和柯萨奇病毒A10(CVA10)，导致共同感染和病毒基因重组，这使得防控手足口病更具挑战性。
01 研究初衷
2022年12月21日，中国科学院分子病毒学与免疫学重点实验室Chao Zhang团队在Nature上发表一篇名为《Molecular mechanism of antibody neutralization of coxsackievirus A16》的文章，他们设计实验的初衷是研究两种 CVA16 特异性中和单克隆抗体 (MAb) 9B5 和 8C4 的功能和工作机制，从而改善目前没有可用于柯萨奇病毒CVA16 的疫苗或抗病毒剂的困境。
02针对 CVA16 的中和 MAb 的鉴定
为了制备CVA16 特异性中和MAb，用灭活CVA16（菌株SZ05）免疫小鼠，从中产生杂交瘤细胞，获得了三个具有中和活性的稳定杂交瘤单克隆（8C4、9B5和9G1）。分别测试了同种型和中和作用、细胞活力、病毒颗粒的结合动力学等参数。
图1：抗 CVA16 MAb 的中和、结合亲和力和相互竞争
根据结合竞争的结果，三个MAbs可以被分为两个非竞争性的抗体组：第1组由9B5和9G1组成，第2组由8C4单独构成。MAb 9B5比第1组中的9G1和第2组中的8C4具有更强的中和作用，被选为两个抗体组的代表进行后续深入分析。
03 8C4和9B5的预防和治疗功效
给几组刚出生1天的 ICR 小鼠注射 PBS、10 mg/kg 的抗 CVA16 单克隆抗体 8C4 或 9B5、8C4 和 9B5 的组合（每种抗体 10 mg/kg），或10 mg/kg 的 IgG 对照抗体 2H2。二十四小时后，小鼠受到 CVA16/MAV 病毒攻击，每天记录小鼠的生命状态和临床评分。
图2：抗 CVA16 MAb 的体内保护功效
除了一只小鼠以外，所有用 8C4、9B5 或 8C4 + 9B5 组合处理的小鼠都表现出健康的生命体征。这些数据证明了 8C4、9B5 和 8C4 + 9B5 组合的起到有效的体内预防功效。
04 MAb 8C4 和 9B5 的中和机制
进行MAb 在哪个步骤发挥抗病毒作用确定。简而言之，培养的细胞要么与单个 MAb 预混合的 CVA16（附着前）接种，要么在病毒附着后（ 4 °C）的不同时间点用 MAb 处理细胞（附着后）。然后，在感染后 6 小时分析细胞的相对病毒 RNA 水平。
图3：MAb 的中和机制
结果表明，附着后 0.5 小时是 8C4 进行中和作用的关键添加时间点，因此 8C4 可能会在病毒进入附着后的早期阶段进行阻断，9B5主要在感染的附着前阶段发挥中和作用。
05 8C4/9B5 混合物可防止病毒逃逸
CVA16-9B5 C1 和 CVA16-8C4 C1 的冷冻电镜图叠加显示 8C4 和 9B5 识别不同的、不重叠的表位，因此可能同时结合相同的表位CVA16 病毒衣壳。因此，这两种 MAb 可以用作非竞争抗体对。通过以 1:1 的比例混合两种抗体来制备 8C4/9B5 混合物，并分析针对 CVA16/SZ05 的中和作用。
图4：MAb 8C4 和 9B5 的组合可防止 CVA16 病毒逃逸突变
8C4/9B5 cocktail 的中和活性略强于单独的 9B5，表明 8C4 与 9B5 联合使用时具有相容性。
综上所述，我们的研究清楚地定义了针对衣壳五重和三重顶点的两组 CVA16 特异性中和 MAb 的功能和工作机制，并证明了 9B5/8C4 抗体混合物显示出更高的中和效力，并获得了一种独特的能力来防止病毒逃逸，这在单个抗体中是可见的。这些发现对抗 CVA16 疫苗和疗法的设计和开发具有重要意义。
卡梅德生物相关服务展示
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步骤 |
服务内容 |
周期 |
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动物免疫 |
* 免疫5只小鼠，进行3-4次免疫 * 采集5只小鼠血清，ELISA检测血清效价 * 提供免疫详细报告 |
4-6周 |
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杂交瘤制备 |
* 选取血清效价满足要求的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 * 有限稀释融合细胞，96孔板克隆化 * HAT筛选杂交瘤细胞 * 经免疫原检测，挑选1-10个阳性克隆，进行亚克隆扩大培养到96孔板 * ELISA筛选阳性亚克隆；并进行扩大培养 * 提供客户1ml上清/阳性克隆，供客户检测 |
4-6周 |
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腹水制备（可选） |
* 客户选取的杂交瘤细胞制备腹水，免疫2只小鼠，Protein A/G纯化腹水，ELISA检测效价 * 提供纯化后抗体，<5mg/clone * 提供实验报告和剩余腹水抗体 注：亦可选择细胞上清纯化 |
1-3周 |
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功能验证（可选） |
ELISA，WB，IF，FLAC，IHC等 |
1-3周 |
02
卡梅德生物使用自研的FastAb (R标)快速佐剂，配合完善的免疫方案专注于制备高效价，高中和效率的中和抗体，可以用于病毒类和病原体的中和抗体的制备，为科研和诊断事业贡献绵薄之力。
03
卡梅德生物基于BLI技术(Octet仪器)进行高质量一体化的分子互作检测服务，可以检测多肽-小分子，蛋白-小分子，蛋白-蛋白结合情况，其中精准亲和力测定服务更为抗体筛选、活性检测和一致性评价以及质量控制提供强有力的理论依据。
卡梅德生物相关产品展示
产品清单：
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编号 |
产品名称 |
物种 |
应用 |
规格 |
价格 |
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PA2005 |
柯萨奇16型/CA16鼠单抗 |
Mouse |
ELISA, WB |
100μg, 500μg |
Inquiry |
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PA2057 |
柯萨奇病毒A16型兔多抗 |
Rabbit |
ELISA, WB |
100μg, 500μg |
Inquiry |
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TA2216 |
柯萨奇16型鼠单抗，HRP标记 |
Mouse |
ELISA |
100μg, 500μg |
Inquiry |
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TA2217 |
柯萨奇病毒A16型兔多抗，HRP标记 |
Rabbit |
ELISA |
100μg, 500μg |
Inquiry |
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VAG1104 |
灭活柯萨奇病毒CA16抗原 |
Virus |
Immunogen, WB, ELISA |
100μl, 1ml |
Inquiry |
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Catalog Number：TA2217 |
Product Name：Rabbit Anti-Coxsackievirus Type A16 PAb, HRP-conjugated |
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Species：Rabbit |
Size：100ug, 500ug |
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SDS-PAGE for Rabbit Anti-Coxsackievirus Type A16 PAb, HRP-conjugated |
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